肛交 细胞成像的超等“放大镜”——4Pi-SIM

人人好！今天来了解一篇4Pi-SIM显微镜参议——《Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100-nm resolution with 4Pi-SIM》发表于《nature methods》，它将3D-SIM与干与显微镜采集，完结各向同性100nm分辨率。通过校正盘算，如剿袭对称布局、水浸物镜等培育相识性，能在固定和活细胞中知晓成像肛交，展示亚细胞结构和动态变化。其在多种细胞样本成像中发达优异，虽存在样品厚度限度等问题，但仍在细胞生物学参议中具有精深应用远景，有望助力深远讨论细胞隐私。

*本文只作念阅读条记共享*

一、序论

在细胞生物学范围，深远讨论活细胞的三维行径及动态变化，关于揭示细胞进程的隐私和生命的基自己分至关迫切。荧结义微镜看成常用器用，虽具分子特异性且适用于活细胞样本，但分辨率受光衍射限度，难以知晓分辨小于200nm的细胞特征。而超分辨率技艺的出现改善了这一现象，其中结构化照显着微镜（SIM）具有与传统荧光团兼容、光毒性低和成像速率快等上风。在此配景下，4Pi-SIM应时而生，它在3D-SIM基础上进一步校正，通过协同3D-SIM与干与显微镜，完结了各向同性光学分辨率，为亚细胞结构和能源学参议带来新打破。

二、4Pi-SIM的技艺旨趣

（一）分辨率培育机制

4Pi-SIM通过六个照明光束在样本平面干与以及两个物镜检测到的荧光波前联系组合来完结各向同性三维分辨率。在空间频率空间中，其照明OTF与检测OTF赈济卷积，产生灵验4Pi-SIMOTF，从而培育分辨率。举例， OTF测量后果可知晓看到，4Pi-SIM比较3D-SIM和WF显微镜在分辨率上有显赫培育。

（二）技艺校正措施

1、相识性优化

为提高相识性，4Pi-SIM剿袭对称光学布局，中枢光机组件置于单个垂直铝板上，减少热波动和机械振动对干与腔（4Pi腔）的影响。举例，在推行中，这种布局确保了成像进程的相识性，使得在永劫候成像时仍能获得高质地图像。

使用水浸物镜替代油浸物镜，匹配水性样品折射率，镌汰相位瑕疵。同期，再行盘算的OPLD退换模块可快速精准微调OPLD至接近零，这对产生最大轴向条纹对比度至关迫切。聚焦锁定模块则保证物镜在成像进程中长久精准瞄准。

2、调制对比度增强

在照明光束旅途中，为保执六个输入光束的s偏振以最大化SIM分辨率推广智商，剿袭HS-LCVR和QWP组合。可是，照明光路中的光学元件会导致s和p偏振光相位不等，使线偏振光退化为椭圆偏振光，镌汰调制对比度。为此，通过特定的光学元件布局，如将HS-LCVR与镜子的s偏振对皆，再行定位QWP，可抵偿相位差，灵验改变照明光的偏振态。

3、OPLD料到与抵偿

由于成像时保执4Pi腔OPLD为零极具挑战性，4Pi-SIM通过再行树立检测旅途，同期拿获两个互补图像，诳骗其相位关系料到OPLD，并将其纳入图像重建进程。举例，在本色操作中，通过对两个检测干与条纹的FT分析，可索要OPLD联系信息，进而合成与OPLD匹配的4Pi-SIMOTF库，用于抵偿OPLD变化，减少轴向条纹伪影，提高图像质地。

三、4Pi-SIM的性能评估

（一）分辨率测试

为评估4Pi-SIM的分辨率，参议东谈主员对100nm荧光珠进行成像，并测量其FWHM。从图1b-f可知，4Pi-SIM的轴向分辨率达102.2±4.6nm，横向分辨率为108.1±4.0nm，比较3D-SIM（轴向分辨率322.9±16.9nm，横向分辨率107.7±4.7nm）和WF显微镜（轴向分辨率561.6±10.9nm，横向分辨率246.7±4.3nm），分辨率培育显赫。在对固定COS-7细胞中免疫瑰丽的微管成像时，相同阐述了4Pi-SIM在生物样本中能保执高分辨率。

（二）成像智商展示肛交

1、固定细胞成像

4Pi-SIM在固定细胞成像中发达出色。在对固定HeLa细胞中线粒体的外膜成像时，得手刻画出其互连空洞，而3D-SIM因轴向分辨率低，生成的空洞呈轴向拉长状，WF显微镜则迷漫无法知晓呈现外膜的中空结构。

在对固定COS-7细胞中免疫瑰丽的波形卵白成像时，4Pi-SIM大致灵验分袂交汇的纤维，3D-SIM则常将不同纤维误判为轴向一语气结构。

此外，对培养的原代神经元中免疫瑰丽的βII-血影卵白以及小鼠精母细胞核中减数分裂前期粗线期的联会复合体成像，均展示了4Pi-SIM在分析复杂三维结构方面的超卓智商。

2、活细胞成像

诳骗水浸物镜，4Pi-SIM可对活细胞进行时候推移体积各向同性成像。举例，在对活HeLa细胞中的线粒体成像时，知晓捕捉到线粒体膜的动态行径，包括时势变化、纳米地谈酿成以及和会和裂变进程。

在对活COS-7细胞中的细胞骨架成像时，不雅察到微管滋长和肌动卵白丝的多种动态重塑事件，如肌动卵白黑点结构的酿成与隐没、丝状伪足中肌动卵白丝的再行散播和削弱等。

3、双色成像

4Pi-SIM通过剿袭大斯托克斯位移荧光卵白dCyOFP2s与绿色荧光卵白采集，完结了用单个激勉波前途行双色成像。在对活HeLa细胞中内质网和线粒体的双色成像中，不雅察到二者在特定区域的时常互相作用，如内质网与线粒体纳米地谈的斗争，以及线粒体在斗争位点的和会和裂变事件。

在对活COS-7细胞中内质网和微管的双色成像中，展示了二者复杂的交汇和动态互相一语气。

四、4Pi-SIM的上风与局限

（一）上风

4Pi-SIM完结了约100nm的三维各向同性分辨率，大致详备呈现从细胞骨架到各式膜结构等庸碌的亚细胞结构，为细胞生物学参议提供了前所未有的知晓度和细节。

可对活细胞进行永劫候、高速率的成像，且对细胞毒性低，与多种荧光卵白和惯例荧光团兼容，适用于多种生物样本的参议。

具备双色成像智商，为参议细胞器间的互相作用提供了有劲技巧，有助于深远和会细胞内的生理进程。

（二）局限

现在4Pi-SIM受样品厚度限度，宽泛适用于厚度小于10μm的样品。这主如果由于其剿袭的宽场照明景色易导致配景搅扰，且双物镜干与成像对生物样本的折射率不均匀性明锐，会产生光学像差，镌汰图像质地。

双色成像性能受长斯托克斯位移荧光卵白的选定和特点限度，现在多色成像智商有待进一步拓展，以纵脱更复杂的生物学参议需求。

五、4Pi-SIM的应用远景

4Pi-SIM在细胞生物学参议中具有精深的应用远景。它有望鼓动对亚细胞结构动态变化、细胞器间互相作用以及细胞生理进程分子机制的深远参议，为揭示生命隐私提供更多迫切陈迹。跟着技艺的赓续发展和校正，如措置样品厚度限度、拓展多色成像智商等，4Pi-SIM将在细胞生物学范围施展更大的作用，助力科学家们取得更多新的发现。

六、沿途来作念作念题吧

1、4Pi - SIM 完结各向同性三维分辨率的要道在于（ ）

A. 单个物镜的高数值孔径

B. 六个照明光束和两个物镜检测荧光波前的干与

C. 极端的荧光瑰丽秩序

D. 加多照明光的强度

2、在对 100nm 荧光珠成像时，4Pi - SIM的轴向分辨率比较 3D - SIM 提高了约几倍？（ ）

A. 1倍

B. 2倍

C. 3倍

D. 4倍

3、在活细胞成像中，4Pi - SIM 不雅察到线粒体的动态行径不包括以下哪一项？（ ）

A. 酿成纳米地谈

B. 与内质网和会

C. 分裂为多个小线粒体

D. 从杆状篡改为凹盘状

4、以下哪一项不是 4Pi - SIM 的上风？（ ）

A. 完结各向同性高分辨率成像

B. 可进行永劫候活细胞成像

C. 对样品厚度无尽度

D. 能进行双色成像

参考文件：

Ouyang， Z.肛交， et al. Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100-nm resolution with 4Pi-SIM. Nat Methods (2024).